2023-08-02
二硫苏糖醇(化学名:DL-二硫苏糖醇,简称:DTT)是一种小分子有机还原剂。DTT主要应用在核酸提取/保护、IVD试剂盒、蛋白质中二硫键的还原、化学镀镍等领域。本周亚科股份小编介绍一下DTT在蛋白质中二硫键的还原中的应用。
近年来,糖尿病的发病率呈现出逐年上升的趋势,大量的临床实践证实,用重组人胰岛素注射液治疗糖尿病可取得理想的效果。
目前重组人胰岛素原融合蛋白复性方法存在以下技术缺陷:
(1)稀释复性:增加体积较大,变性剂稀释速度太快,不易控制,且复性时蛋白含量较低,一般2mg/mL以下,复性率在60%左右。
(2)透析复性:不适合大规模生产,无法应用到生产规模,且易形成无活性蛋白质具体。
(3)柱上复性:生产工艺复杂,且增加生产成本。
因此开发一种适于工业化生产的重组人胰岛素原融合蛋白复性方法,克服现有技术缺陷,具有重要的意义。
CN105732820B专利中提供了一种重组人胰岛素原融合蛋白的复性方法,具体包含以下步骤:
1)将表达重组人胰岛素原融合蛋白的大肠杆菌进行破碎,收集包涵体;
2)使用包涵体洗涤液对于包涵体进行洗涤;
3)去除洗涤液后,在包涵体里加入变性剂;
4)加入终浓度为10mM巯基还原剂(DTT),获得还原蛋白溶液;
5)将配好的复性缓冲液缓慢加入4)中的还原蛋白溶液中,轻微搅拌,进行重组人胰岛素原融合蛋白的复性,得到优化的复性蛋白溶液。
相对于现有技术,本发明针对一种重组人胰岛素原融合蛋白,复性浓度由现有技术中的0.3~2mg/mL提高至5~10mg/mL,提高复性率至80%-90%,后续工艺经简单纯化即可。本发明所采用的试剂简单易得,且各步骤操作简单,快速高效,所有操作过程在室温或4℃环境下进行,大大降低生产成本,适合工业化大规模重组人胰岛素的生产。
参考文献
CN105732820B 一种重组人胰岛素原融合蛋白的复性方法